功能 环境因子关联分析

相关关系

研究中涉及的对象之间有错综复杂的联系，这些联系有的紧密，有的稀松。表达相互联系事物的联系有两种方式：相关关系和回归关系（函数关系）。相关关系不是确定关系，当一个或几个事物的取值发生变化时，与它（它们）有联系的事物的取值也会发生变化，但变化值不是确定的数值。回归关系是一种确定关系，通过一个或几个事物的取值能够得到另一个事物的取值，这是通过回归方程（函数方程）实现的。相关关系中两个变量的地位是一样的，并不是因为一个变量发生变化而导致另一个变量发生变化，所以相关关系并不表示因果关系，而回归关系人为定义了自变量和因变量，自变量和因变量是根据物理量的现实关系来确定的，因此回归关系通常是有因果关系的。基于这些区别，在数据分析中，一般先做相关关系的分析，待相关关系清楚以后，再进一步确定不同变量之间的函数关系（回归关系）。

在实际的研究中，相关性计算通常是基于实验取得的样本数据，当需要将这个样本数据推广到群体时（群体中的某个差异是否由相关数据的变异引起），需要进行统计推断。

样本：总体的一部分，通常表示实验采样，是可以获得的数据
总体：所有的样本数据，通常是难以获得的

相关关系分类

相关关系从不同的角度有不同的分类方式。首先是按照相关关系强度划分：完全相关，弱相关和不相关。也能按照相关关系的方向分类：正相关和负相关。以上两种是最常用的分类方式。除此之外，还有两种分类方式，需要重点介绍。

• 按照相关关系形态划分，可以分为线性相关和非线性相关。当一个变量的值发生变化时，另外一个变量也发生大致相同的变化。在直角坐标系里，两个变量的观测值的分布大致在一条直线上，那么这两个变量之间的相关关系是线性关系；如果在直角指标系内，两个变量的观测值分布是一条曲线，那么它们之间的相关关系是非线性相关。
• 还有一种相关关系的划分原则是按照变量的个数划分，可以分为单相关，复相关和偏相关。单相关是两个变量之间的关系，这两个变量一个是因变量，一个是自变量。两个变量的相关关系分析也被称为二元变量相关分析。复相关是指三个或三个以上的变量之间的关系，即一个因变量对两个或两个以上自变量的相关关系。偏相关综合了单相关和复相关的特点，当一个变量与多个变量相关，但是只关心其中一个因变量与自变量的关系，需要屏蔽其他因变量对自变量的影响，这样的相关关系就叫做偏相关。

两变量相关分析

两变量相关分析是分析对象（样本）内变量两两之间的相关程度（一个变量的变化和另一个变量变化相近或相反的程度），如环境样本中某种微生物的丰度和环境 PH 是否相关，PH 和温度是否相关。需要注意是无论相关性强度如何，相关关系并不能表示因果关系。

相关系数

两个变量的相关性通过相关系数进行描述，常用的相关系数有 Pearson 相关系数（适用于定量数据，且数据满足正态分布，线性相关）、Spearman 相关系数（定量或等级数据，任何分布模式，非线性相关）、Kendall 相关系数（有序定类变量，非线性相关）。相关性分析计算结果是没有单位的，因此不同数据类型之间的同种相关性是可以直接比较的。此处仅介绍宏基因组分析中常用的 Pearson 相关系数和 Spearman 相关系数。

Pearson 相关系数计算

Pearson 相关系数（Pearson correlation coefficient）用于度量两个连续变量之间的线性相关程度，用字母 $r$（样本间，实验取样样本数据）或希腊字母 $\rho$（群体间，某实验组的所有样本）表示。其取值范围是 $[-1, +1]$，取值为 1 时表示正线性相关性，取值为 0 时表示非线性相关性，取值为 -1 时表示负线性相关性。在使用 Pearson 相关系数时，应该注意如下使用条件：

1. 两个变量之间需要存在线性相关关系，因为在非线性相关中，Pearson 相关系数的大小不能表示相关性的强弱。
2. Pearson 相关系数要求相应的变量呈双变量正态分布。双变量正态分布并非简单的要求 x 变量和 y 变量各自服从正态分布，而是要求服从一个联合的双变量正态分布。

Pearson 相关系数的计算公式如下：

$$r_{x, y} = \frac{cov(x, y)}{\sigma_x\sigma_y}$$

$cov(x, y)$：变量 x，y 的协方差

$\sigma_x$：变量 x 标准差

$\sigma_y$：变量 y 的标准差

另外还需注意：

1. 若样本中的极端值对 Pearson 相关系数的影响极大，因此要慎重考虑和处理，必要时可以对其进行剔除，或者进行变量转换以避免异常数值导致结论错误
2. 变量不能有缺失值，有缺失值的变量无法进行计算
3. 若其中一个变量没有发生变化，其标准差为 0，此时计算公式中的分母为 0，无法计算结果，因此任变量不能完全相同

Spearman 相关系数

Sperman 相关系数 ^[1] 使用两变量的秩次大小为分析依据，因此对原始变量的分布没有要求，即使原始数据是等级资料（如两种药物对某种疾病症状的疗效等级：无效、好转、显效）也可以计算 Spearman 相关系数。对于服从 Pearson 相关系数的数据也可以计算 Spearman 相关系数，但统计效能比 Pearson 相关系数要低一些（不容易检测出两者事实上存在的相关关系）。如果数据中没有重复值，并且当两个变量完全单调相关时，斯皮尔曼相关系数则为 +1 或 −1。Spearman 相关系数即使出现异常值，由于异常值的秩次通常不会有明显的变化（比如过大或者过小，那要么排第一，要么排最后），所以对 Spearman 相关性系数的影响也非常小。Spearman 相关系数用希腊字母 $\rho$ (rho) 表示。

计算公式：

$$\rho_{X, Y} = 1-\frac{6\sum_i{d_i^2}}{n(n^2-1)}$$

$d_i$：成对指标X，Y的秩次差

$n$：变量中数据的个数

相关系数统计推断

为了将样本相关性 $r$ 推广到总体相关性 $\rho$，需要进行统计推断。

• Pearson 系数：当样本量（n > 30）很大时相关系数 r 服从正态分布，否则认为样本服从 t 分布，因此统计推断使用的统计量是 t。
• Spearman 系数：

其零假设 $H_0$ 为两样本不相关，即 $\rho$ = 0，备择假设 $H_1$ 为两样本相关。t 的计算公式如下：

$$t = r\sqrt{\frac{n-2}{1-r^2}}$$

$r$：相关系数

$n$：样本量

t 符合自由度为 n-2 的 t 分布，根据 t 值和自由度在 t 值分布表中即可找到对应的 $P$ 值，通常认为 $P < 0.05$，两者显著相关。

请注意：

1. 相关性强（ $|r| > 0.5$ ）的两变量，其相关关系并不一定显著；同理，相关性弱，也不一定相关关系不显著。尤其是当样本量比较少的时候，可能会错误拒绝零假设，即认为犯了显著检验的 Ⅰ 型错误。因此当样本量较少时应该谨慎得出显著相关的结论。
2. 另外，还需注意显著检验使用的是单尾还是双尾。微生物分析中中常用的是双尾检验。

线性回归

在数据分析中，一般先做相关关系的分析，待相关关系清楚以后，再进一步确定不同变量之间的函数关系（回归关系）。线性回归（Linear Regression）是利用数理统计中回归分析，来确定一个或多个自变量和因变量之间关系的一种统计分析方法。环境因子排序回归分析，以环境因子大小作为 x 轴，根据排序分析如 PCA 分析等结果的第一排序轴上的分值或 Alpha 多样性指数大小为 y 轴，并进行线性回归（Linear Regression），做散点图，标注 R2，可用于评价二者间的关系。其中 R2 为决定系数，代表变异被回归直线解释的比例。为了使分析效果较好，样品个数应越多越好，建议 10 个样品以上。

两矩阵相关分析

CCA / RDA

CCA 或 RDA 是基于对应分析发展而来的一种排序方法，将对应分析与多元回归分析相结合，每一步计算均与环境因子进行回归，又称多元直接梯度分析。此分析是主要用来反映菌群与环境因子之间关系。RDA 是基于线性模型，CCA 是基于单峰模型。分析可以检测环境因子、样本、菌群三者之间的关系或者两两之间的关系。CCA 和 RDA 的结果图中使用点代表不同的样本，从原点发出的箭头代表不同的环境因子。箭头的长度代表该环境因子对群落变化影响的强度，箭头的长度越长，表示环境因子的影响越大。箭头与坐标轴的夹角代表该环境因子与坐标轴的相关性，夹角越小，代表相关性越高。

RDA 或 CCA 模型的选择原则：先用功能丰度表做 DCA 分析，看分析结果中 Lengths of gradient 第一轴的大小，如果大于 4.0，就应该选 CCA；如果 3.0-4.0 之间，选 RDA 和 CCA 均可（本分析 ≧ 3.5 选择 CCA）；如果小于 3.0，RDA 的结果要好于 CCA。

（1）通过 bioenv 函数判断环境因子与样本功能分布差异的最大 Pearson 相关系数，通过最大相关系数得到环境因子子集。
（2）将样本功能丰度表与环境因子或环境因子子集分别做 CCA 或者 RDA 分析。
（3）通过类似于 ANOVA 的 permutest 分析来判断 CCA 或者 RDA 分析的显著性。

Mantel Test

Mantel test 是以 Nathan Mantel 命名的统计学检验方法，首次发表于 1967 年 ^[2]。Mantel test 关注两个相同维度矩阵的相关关系，在生态数据中应用广泛，常用来分析样品丰度距离矩阵和环境因子距离矩阵的相关关系，此时检验的目标是样本之间的变异是否和环境因子变异相关。

常见问题

Q：怎样选择用 CCA 还是 RDA 来进行环境因子对群落结构影响的展示？

A：RDA 或 CCA 模型的选择原则：RDA 是基于线性模型，CCA 是基于单峰模型。一般会选择 CCA 来做直接梯度分析。但是如果 CCA 排序的效果不太好，就可以考虑用 RDA 分析。

先用物种丰度数据做 DCA（Detrended Correspondence Analysis） 分析，分析结果中 Lengths of Gradient 的第一轴的大小。如果大于 4.0，就应该选 CCA；如果 3.0-4.0 之间，选 RDA 和 CCA 均可；如果小于 3.0，RDA 的结果要好于 CCA。

Q：CCA 和 RDA 环境因子数必须小于样本数的原因是什么？

A：二者都属于约束性排序， CCA 属于非线性模型；RDA 属于线性模型；先看 PCA 的排序， 其未设置环境因子是一种非限制性， 所找到的主成分是可以说一种未知的环境变量； 而约束性排序是指在特定的环境变量（环境因子）上进行排序，即提供坐标轴方向进行排序； 如有n个样品，提供n个坐标方向，就起不到这种特定方向的约束的作用了。

参考文献：
Legendre, P. and L. Legendre (2012). Numerical Ecology, 3rd English ed. Amsterdam: Elsevier Science BV.

Q：CCA 和 RDA 的变量要求是具体数值的原因是什么？

A：CCA 和 RDA 是环境因子的关联性分析，算法模型要求环境因子数据是连续性的（数据是有大小、顺序的数字），比如测定的 pH 值，温度等。 同时非连续型变量不能作为环境因子数据；比如说：对比用药组和对照组的不同，这是将加入了药物记为 1， 没有加入的记为 0，这类变量属于非连续性变量 (或者叫离散型)，可以作为分组变量。

Q：Pearson 相关系数和 Spearman 相关系数的区别？

A：Pearson 相关系数适用于定量数据，要求数据满足正态分布、数据之间有线性相关，Spearman 相关系数适用于定量或等级数据，数据符合任何分布模式均可，参与计算的数据通常为非线性相关。

小贴士

除非特别说明，Dr.Tom 默认使用的是 Spearnman 相关性系数，阈值为相关性系数绝对值大于 0.3 且 p 值小于 0.05

参考文献

---

1. Best, D. J., & Roberts, D. E. (1975). Algorithm AS 89: The Upper Tail Probabilities of Spearman’s Rho. Journal of the Royal Statistical Society. Series C (Applied Statistics), 24(3), 377–379. https://doi.org/10.2307/2347111 ↩︎

2. Mantel, N. (1967). The Detection of Disease Clustering and a Generalized Regression Approach. Cancer Research, 27(2), 209–220. ↩︎